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生猪疫病控制岗位揭示猪圆环病毒2型诱导PK-15细胞凋亡的新机制

发布时间：2022-03-11作者：来源：点击：

       病毒作为一类严格的胞内寄生物，完全依赖于宿主的翻译系统合成病毒蛋白从而实现病毒的快速复制，其复制过程也会造成细胞凋亡等细胞损伤的发生，引发一系列细胞生物学事件。近日，畜牧兽医研究所在《Frontiers in Microbiology》（IF=5.64）发表最新研究论文：“PCV2 Triggers PK-15 Cell ApoptosisThrough the PLC–IP3R–Ca2+Signaling Pathway”。研究表明：猪圆环病毒2型（PCV2）感染宿主细胞后，通过激活PLC-IP3R-Ca2+信号通路，促进细胞内Ca2+的释放，触发PK-15细胞内质网应激现象，诱导细胞凋亡。通过探索病毒与细胞凋亡之间的关系，对于探索和揭示病毒的致病机制，寻找宿主细胞的抗病毒靶点具有重要意义。
 
 
猪圆环病毒（Porcine circovirus，PCV）是单股闭合DNA病毒，病毒粒子直径14-17nm，呈20面体对称结构，无囊膜，是已知的最小的动物类病毒。根据核酸序列、致病性等差异分为PCV1、PCV2和PCV3。PCV2是猪圆环病毒相关疾病（Porcine circovirus associated diseases，PCVAD）最常见的致病病毒之一，PCV2能够引发多种临床症状，广泛流行于全世界并对养猪业造成严重的影响。
内质网（Endoplasmic reticulum ,ER）在胞内Ca2+浓度平衡和蛋白质生物合成中起重要作用。在感染过程中，病毒需要在ER的帮助下完成其生命过程。同时，内质网也产生内质网应激（Endoplasmic reticulum Stress, ERS），诱导细胞凋亡以抵抗病毒感染。该研究探讨了PCV2感染PK-15细胞后Ca2+ 浓度、ERS和细胞凋亡机制。应用探针法对PCV2感染后细胞质Ca2+水平以及细胞凋亡情况进行检测，发现感染后的PK-15细胞质Ca2+浓度升高、细胞凋亡情况加剧。在透射电镜下观察到病毒感染的细胞和未感染的对照组在形态上有显著差异：病毒感染组的内质网肿胀，附着的核糖体减少，核周间隙肿胀（图1）。通过激光共聚焦显微镜观察细胞质中磷脂酶C (PLC)和肌醇1,4,5-三磷酸受体(IP3R)在内质网膜上的共定位（图2）。
 
图1 电镜下观察到PK-15细胞内质网应激现象
 
 
图2 PLC与IP3R共定位于PCV2感染的PK-15细胞
蛋白质印迹和实时荧光定量PCR实验证实PCV2感染后 PLC和IP3R表达水平增加，细胞质中的Ca2+浓度增加（图3）。此外，PCV2感染后，IP3R和PLC的mRNA表达显着上调, 相对于未感染组分别增加了3.72倍和2.83倍，添加PLC 和IP3R抑制剂后，IP3R和PLC的mRNA表达降低（图4）。以上结果均表明PCV2感染通过PLC-IP3R-Ca2+信号通路触发PK-15细胞的ERS以促进释放细胞内Ca2+，导致细胞凋亡。
 
 
图3  不同蛋白在PCV2感染后PK-15细胞中的表达量变化
 
图4 PCV2感染过程中PK-15细胞PLC和IP3R的mRNA表达水平变化
       当细胞受到外部环境的刺激时，细胞就会将Ca2+释放到细胞质中。当Ca2+浓度达到一定阈值后，钙依赖的内源性内切酶被激活，DNA被分解为180-200 bp的寡核苷酸，导致细胞凋亡。该研究发现，PCV2感染使细胞内Ca2+浓度增加，引起内质网应激及现象。使用药物干扰病毒引起的ERS，可以减少病毒复制，内质网应激缓解剂4-PBA可以减轻PCV2对PK-15细胞ER的应激并影响PCV2 Cap蛋白的表达（图3）。IP3R和PLC是Ca2+依赖性细胞蛋白，PLC刺激IP3与IP3R的结合，打开内质网Ca2+通道，使Ca2+流入细胞质。该研究首次观察到PLC和IP3R在PK-15细胞质中的共定位，初步验证了PCV2攻击宿主细胞后，通过PLC-IP3R通路使PK-15细胞质中的Ca2+浓度升高，导致细胞凋亡的发生。该研究有助于揭示病毒的复制和发病机理，为未来的研究和抗病毒药物提供新的思路。
畜牧兽医研究所王硕博士生、李琛博士和孙盼盼硕士为论文的共同第一作者，李俊研究员、王兆博士为共同通讯作者。该研究得到山东省重大科技创新项目、省现代农业产业技术体系等资助。

论文链接：
https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmicb.2021.674907/full